原理
細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細胞能繼續(xù)生長,同時也將細胞數量擴大,就必須進行傳代(再培養(yǎng))。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。
材料和試劑
1. 細胞:貼壁細胞株
2. 試劑:0.25%胰酶、1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清)
3. 儀器和器材:倒置顯微鏡、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等
操作步驟
1. 吸除培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。
2. 向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許,以能覆滿瓶底為限。
3. 置溫箱中2~5分鐘,當發(fā)現細胞質回縮,細胞間隙增大后,立即終止消化。
4. 吸除消化液,向瓶內注入Hanks液數毫升,輕輕轉動培養(yǎng)瓶,把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時,動作要輕,以免把已松動的細胞沖掉流失,如用胰蛋白酶液單獨消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液沖洗,直接加入培養(yǎng)液。
5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
6. 計數板計數后,把細胞懸液分成等份分裝入數個培養(yǎng)瓶中,置溫箱中培養(yǎng)。
無菌操作注意事項
1. 操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2. 點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3. 操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
5. 瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。
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